米兰·(milan)-外泌体：极具潜力的再生医学技术及药物递送工具

外泌体是一种40~160nm的细胞外囊泡，可由血细胞、免疫细胞、肿瘤细胞、干细胞等于内的险些所有类型的细胞排泄，并漫衍于各类体液中。外泌体是细胞间通信的要害介质，和各类心理及病理历程中的功效介质。

研究发明，外泌体可以穿梭卵白质、脂质、RNA及DNA等生物活性份子，且具备高生物使用度、生物不变性、靶向特异性、低毒性及低免疫原性，使患上外泌体于疾病诊断、医治和药物递送中极具潜力。

美国ClinicalTrials临床实验数据库资料显示，外泌体可作为肺癌、乳腺癌、结肠直肠癌等差别肿瘤的诊断生物标记物或者医治药物，还有可作为药物递送体系、肿瘤疫苗；此外，外泌体还有可用在再生医学。然而，至今还没有有任何的外泌体疗法核准上市，外泌体的临床转化仍面对着诸多问题和挑战。

外泌体成长过程

外泌体是细胞外囊泡常见亚群之一。EV是由生物细胞排泄的纳米级具备双层膜布局的囊泡，是各类具备膜布局的囊泡的统称，重要包括外泌体和微囊泡、微粒、外体、迁徙体、肿瘤体及凋亡体等。现代研究证实，外泌体可影响肿瘤的各类生物学历程，包括细胞增殖、肿瘤转移、血管天生、肿瘤耐药及免疫反映等。

1981年，Trams等人从各类正常细胞及肿瘤细胞中造就出具备5′-核苷酸酶活性的脱落囊泡，囊泡的平均直径为500~1000nm，而且凡是含有直径约40 nm的第二群囊泡，这是关在外泌体的最初描写。1983年，Harding等人及Pan等人别离于年夜鼠及绵羊网织红细胞中，不雅察到含有未降解的转铁卵白受体与直径约50 nm的小囊泡发生彼此作用。随后于1987年Johnstone将其正式定名为“外泌体”。

2013年，James E. Rot hman、Randy W. Schekman及Thomas C. Südhof三位科学家因发明并阐释细胞囊泡运输体系和调控机制而得到诺贝尔心理学或者医学奖。

外泌体的构成和心理功效

外泌体含有DNA、RNA、mRNA、脂质、代谢物、细胞质及卵白质等多种生物份子。研究显示，今朝已经于外泌体中鉴定出9769种卵白质、2838种miRNA、3408种mRNA及1116种脂质。此中，细胞膜通例的四跨膜卵白（CD九、CD6三、CD81等）、热休克卵白70（Hsc70）、溶酶体卵白（Lamp2b）、肿瘤敏感基因101（Tsg101）、交融卵白（CD九、flotillin，annexin）等卵白于外泌体中的浓度较高，可作为外泌体鉴定的生物标记物。

最近几年来，研究发明血细胞、免疫细胞、肿瘤细胞、干细胞等于内的险些所有类型的细胞均可以孕育发生外泌体，举行细胞间通信，从而实现细胞增殖、分解、免疫调治、炎症调控、细胞凋亡等多种生物学功效。

外泌体最初被认为是细胞用来分泌废料的小泡，跟着研究的深切，发明外泌体可介入到机体免疫应对、抗原递呈、细胞迁徙、细胞分解、肿瘤侵袭等。

差别细胞来历的外泌体构成差别，其功效也差别。例如，树突状细胞排泄的外泌体具备MHC肽复合物，可以或许激活T细胞，还有可表达外貌配体，如肿瘤坏死因子配体（TNF）、Fas配体（FasL）及TNF相干的凋亡引诱配体（TRAIL），从而及肿瘤细胞上的TNF受体联合，触发半胱天冬酶活化及肿瘤凋亡。干细胞来历的外泌体包罗与MSCs近似医治性的生长因子和mRNA等生物活性物资，具备免疫调治、构造修复等疗效。癌细胞来历的外泌体能阐扬免疫调治功效，致使免疫按捺或者防止免疫反映。

外泌体的分散要领

今朝，研究职员已经按照外泌体的巨细、密度、外貌电荷以和其外貌相干的卵白质开发了多种外泌体分散要领，重要包括超速离心、超滤、体积排阻色谱、免疫亲及捕捉、聚合物沉淀法及微流控技能（各技能道理和优错误谬误见下表）。

由表1可知，外泌体分散要领已经获得年夜量扩大，经常使用要领有差速超速离心、密度梯度离心法、沉淀法、过滤法、体积排阻色谱法以和免疫亲及捕捉法等，此中差速超速离心仍是持久以来外泌体分散的“金尺度”。然而，今朝分散技能都存于必然缺陷，怎样提高外泌体分散的纯度、效率及质量仍是霸占外泌体分散技能难题的重要挑战。

外泌体临床运用

外泌体险些存于在所有的细胞、构造及体液中，是介导细胞间通信的主要介质。研究认为，外泌体可经由过程与细胞膜直接交融，以和经由过程内吞路子或者配体-受体彼此作用于细胞间通信中阐扬作用，从而介入到机体免疫应对、抗原递呈、细胞迁徙、细胞分解、肿瘤侵袭等。

今朝，外泌体被广泛用在生物标记物、药物载体及疾病医治研究中。

药物递送体系

外泌体可经由过程内吞作用或者颠末囊泡及细胞膜的直接交融进入受体细胞，使其内容物运送到细胞质中并激发功效反映。如来自抗原呈递细胞（树突状细胞）的外泌体可以经由过程将负载肽的MHCⅠ类及Ⅱ类复合物转移到T细胞，来调治免疫细胞反映。

外泌体作为一种潜于的药物递送体系，近似在脂质体，具备包裹亲水焦点的怪异双脂膜，可装载亲水及亲脂质料；因为外泌体具备差别脂质、外貌卵白、受体等，具备更好的构造及细胞靶向性；此外，外泌体由细胞自身孕育发生，具备较好的生物相容性、低免疫原性及低毒性，可防止外源性的卵白类、核酸类等药物进入体内被免疫体系辨认而受到断根。今朝，运用外泌体载药的药物类型重要为小份子化药、核酸及卵白质。

外泌体载药方式可以分为外源性装载（即外泌体分散后）及内源性装载（即外泌体生物发生时期）两种。

内源性装载是于外泌体形成的生物历程中，经由过程直接转染、共孵育等要领将目的药物导入外泌体来历细胞，来历细胞再经由过程生物发生气希望制孕育发生具备目的药物的外泌体。今朝，内源性装载可装载RNA、卵白质、小核酸及小份子等差别类型药物。

外源性装载是经由过程电穿孔或者脂质体转染等要领将目的药物导入分散后的外泌体中。今朝，外源性装载可装载小份子化药、卵白质、多肽、核酸药物、自然产品等，装载药物方式重要包括直接共孵育、电穿孔、超声处置惩罚、转染、挤压、冻融、外貌活性剂透化（详见下表）。

诊断和预后标记物

外泌体已经被证实有望用作很多疾病的诊断及预后生物标记物，包括乳腺癌、泌尿道癌、肺癌、胃癌、肝癌、结直肠癌、卵巢癌等癌症，以和帕金森病、阿茨海默病等中枢神经体系疾病，而且关在外泌体作为诊断东西的研究正于迅速扩大到其他疾病。

今朝研究成果显示，外泌体卵白、miRNA、circRNA、l ncRNA均具备潜于的诊断及医治价值，如外泌体卵白CD2六、CD8一、S1C3A1及CD10可用作为肝毁伤潜于的生物标记，外泌体miR-21及miR-1246于乳腺癌患者中升高更为显著，可作为乳腺癌的生物标记物。外泌体生物标记物与传统生物标记物（血清、尿液等）比拟，具备更高的敏捷度及特异性，以和更精彩的不变性。

疾病医治

最近几年来，研究证明外泌体对于多种疾病具备医治潜力。例如，研究发明，外泌体可以穿过血脑樊篱，作为炎症反映及神经毁伤再生的调治剂；从心球源细胞中分散的外泌体，当打针到缺血小鼠模子中时，可以按捺细胞凋亡并引诱心脏细胞的生长，等等。外泌体的医治作用基在其细胞内穿梭能力、穿越血脑樊篱能力、低免疫原性、调治免疫体系以和增长或者按捺炎症的能力等。

与干细胞比拟，外泌体于临床医治的潜于上风包括：无任何基在细胞的疗法（包括干细胞）相干的固有危害；无复制潜力及恶性转化的危害；可防止对于传染及癌症的免疫原性反映；可直接靶向方针构造或者细胞。

外泌体临床研究进展

据美国ClinicalTrials数据库资料显示，截至2023年8月21日，ClinicalTrials共挂号了182项关在外泌体的临床研究，重要触及外泌体生物标记物、外泌体医治、外泌体药物递送体系。

182项外泌体范畴的临床研究中，有90项（49.45%）是关在生物标记物的运用，59项（32.97%）为外泌体医治药物研究，8项（4.40%）关在药物递送体系，22项（12.09%）属在外泌体基础阐发研究；此外，疫苗类临床研究有3项（1.10%）（详见图）。

上述59项外泌体医治药物的临床研究中，可明确临床实验阶段的有46项。此中，Ⅰ/Ⅱ期临床实验至多（16项），其次为Ⅰ期（10项），Ⅲ期临床实验起码（2项），Ⅱ/Ⅲ期临床实验有3项。

两项Ⅲ期临床实验触及两款外泌体产物，别离为CAP-100二、Bone Marrow Mesenchymal Stem Cell Derived Extracellular Vesicles。

CAP-1002是由Capricor Therapeutics Inc研发的一种基在外泌体的细胞疗法，拟开发顺应证包括X连锁遗传病、杜氏肌养分不良症、肌病、肌肉萎缩性疾病、肌养分不良、神经肌肉疾病及遗传病。

Bone Marrow Mesenchymal Stem Cell Derived Extracellular Vesicles是由Direct Biologics研发的一种骨髓间充质干细胞衍生的细胞外囊泡疗法，拟开发顺应证包括成人呼吸拮据综合征、克罗恩病、溃疡性结肠炎等。

外泌体范畴代表企业

外泌体自被发明以来，已经历经40余年成长，全世界结构外泌体范畴的企业数目和范围也于不停增加。据公然资料统计，近50家外泌体Biotech公司的研发标的目的重要聚焦于肿瘤（30%）、脑部疾病（16%）、肺部疾病（7%）、皮肤病（5%）、疫苗开发（13%）、医美修护（8%）、肝脏疾病（5%）、肾脏疾病（3%）以和基因医治/稀有病（13%）等范畴。

如下是结构外泌体范畴的代表性企业环境。

Aethlon Medical

Aethlon Medical建立在1999年，是一家上市医疗器械公司，专注在开发肿瘤、感染性疾病和其他一些威逼生命疾病范畴的立异医疗装备。

Aethlon焦点产物Hemopurifier是一款血液净化器，可快速消弭促癌外泌体及轮回病毒。美国食物药品治理局（FDA）已经核准Hemopurifier 为冲破性装备，用在医治对于尺度医治无反映或者不耐受的晚期或者转移性癌症患者，以和外泌体已经被证实介入疾病进展或者严峻的癌症患者，以和尚无获批医治药物的危和生命的病毒。

Aethlon控股子公司Exosome Sciences建立在2017年，致力在开发外泌体生物标记物，以诊断、监测肿瘤和神经体系疾病。今朝正于推进开发TauSomeTM生物标记物，作为诊断活体个别慢性创伤性脑病候选血液测试的基础。

Celularity

Celularity建立在2017年，是一家临床阶段生物技能公司，致力在开发胎盘来历的同种异体细胞疗法及外泌体。细胞疗法包括未经润色和基因润色的NK细胞、工程化T细胞（CAR-T细胞）、间充质样贴壁基质细胞。

该公司开发胎盘外泌体（pEXO）作为潜于的医治要领，可以提供促再生因子，促成神经细胞、血管及肌肉的发育。今朝，该公司外泌体产物管线有1款处在启动新药临床实验（IND）阶段。

Codiak Biosciences

Codiak Biosciences是一家建立在2015年的生物技能公司，也是外泌体范畴第一家上市公司，专注在开发基在外泌体的新型药物疗法。

Codiak开发了其专有的engExTM平台，以扩大外泌体的固有特征，设计、工程及制造新的外泌体医治候选药物。Codiak曾经使用engExTM平台开发了一系列工程外泌体，旨于医治广泛范畴的疾病，包括肿瘤学、神经肿瘤学、精神病学、神经肌肉疾病及感染病等。

然而，Codiak在本年3月29日志愿向美国特拉华州停业法院申请停业掩护，出售资产。

Evox Therapeutics

Evox Therapeutics建立在2016年，是一家临床前阶段生物技能公司，致力在开发基在外泌体的立异疗法来医治稀有病及严峻疾病。

外泌体药物可解决基在卵白质、抗体及核酸疗法的一些局限性，使其可以或许递送到今朝经由过程通例手腕没法达到的细胞及构造。Evox开发了其专有技能平台DeliverEXTM，可使用各类份子工程、药物装载及靶向计谋来润色外泌体，以促成靶向药物递送到感兴致的器官，如年夜脑及中枢神经体系。

今朝，Evox正于开发一系列基在外泌体递送的候选药物，包括针对于成人和儿童苯丙酮尿症的外泌体递送的编码苯丙氨酸羟化酶（PAH）的AAV（腺相干病毒），以和针对于神经退行性疾病的外泌体递送的siRNA药物等。

Xsome Biotech

Xsome Biotech建立在2021年，是一家临床前阶段生物技能公司，致力在开发用在多种疾病的外泌体疗法及新型药物递送载体。

Xsome成立了外泌体再生医学和工程化外泌体药物递送平台。外泌体再生医学平台使用肺球细胞来历的自然外泌体，开发医治肺部疾病候选外泌体疗法产物；工程化外泌体药物递送平台使用HEK293细胞外泌体装载mRNA、重组卵白、小份子药物等，以医治肿瘤、特发性肺纤维化和稀有病等。

今朝，Xsome焦点候选药物XO101已经得到美国FDA的IND许可，用在医治COVID19-ARDS患者；肺球细胞衍生的外泌体候选药物XSO201，也正于预备申报IND。

临床开发面对的重要问题

外泌体于疾病诊断、医治以和药物递送方面的作用已经尽人皆知。然而，从试验室来临床的转化仍旧存于各类挑战。

缺少范围化制备和尺度化要领

外泌体广泛存于在各类体液中，可以从各类类型的细胞中分散出来，差别来历的外泌体，其构成也可能差别。今朝按照外泌体的尺寸、理化特征已经成立了多种外泌体分散要领，但至今最纯净的外泌体是使用蔗糖或者碘沙醇经由过程密度梯度分散要领分散的，然而这类要领耗时长、成本高。其他要领如“金尺度”差速超速离心法的装备昂贵，且离心力可能会粉碎外泌体的布局及功效；微流控技能分散一样存于装备昂贵、产量低的问题。可见，现有外泌体的分散技能没法满意外泌体范围化制备的需求。

此外，缺少尺度化的出产方案，可能致使每一批次间产物的差异，从而影响医治效果。

外泌体药物相干尺度不完美

今朝，于外泌体的分散与鉴定、质量节制等环节尚缺少同一尺度，已经出产或者正于出产中的外泌体也无完备的审批尺度。

于我国，近两年相干研究单元接踵制订了多项关在人多能干细胞、人世充质干细胞来历的细胞外囊泡的集体尺度，包括《人多能干细胞来历的小细胞外囊泡》（T/CRHA 002-2021）、《人世充质干细胞来历的小细胞外囊泡》（T/CRHA 001-2021）、《人干细胞来历细胞外囊泡制备通用要求》（T/CSCB 0007-2022），以进一步鞭策并规范外泌体行业的成长。

然而，现有尺度的引导性仍不足。将来若海内企业申报外泌体产物IND，可能需要与药监部分举行年夜量沟通，IND申报质料及内容可能要年夜量修改。

缺少权势巨子第三方检测专业机构

依据我国药品羁系划定，新药于申报IND时，均应颠末专业第三方检测机构尺度切合性查验及格。然而，今朝中国食物药品检定研究院和其他专业检测机构还没有对于外泌体查验检测成立尺度。

羁系亟待完美

今朝，全世界规模内已经有跨越100多家企业或者私家诊所直接向消费者发卖基在干细胞外泌体的新药物，此中约30%的企业位在美国。美国FDA曾经在2019年12月6日发布关在外泌体产物的大众安全通知，以规范外泌体的上游出产步调，但仍存于企业直接向消费者提供未经证明的外泌体疗法的环境。

只管面对诸多挑战，但外泌体依附其自然形成机制，以和包罗年夜量多样活性生物份子的非凡布局，可以承载多元化的临床价值，于肿瘤医治、细胞替换医治、再生医学、药物载体、科研模子等方面显示了巨年夜运用潜力。信赖跟着技能的冲破，外泌体将会迎来超过式成长。

（药渡咨询 吴夏 吴莎莎）

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